Un approccio One Health: vescicole extracellulari di latte e colostro bufalino inducono effetti immunomodulatori su macrofagi bovini e bufalini e riducono la produzione di VEGF su cellule intestinali tumorali umane

Il latte è composto da diverse componenti nutrizionali e immunologiche, tra cui cellule, globuli di lipidi del latte, micelle di caseina, composti solubili e vescicole extracellulari (VE) (1). Subito dopo il parto, le ghiandole mammarie secernono colostro (Colo), che viene gradualmente sostituito dal latte maturo (LM). Tra le componenti del latte, le VE hanno suscitato grande interesse per la loro capacità di trasportare molecole come proteine, lipidi, mRNA e miRNA, favorendo così la comunicazione intercellulare (2). Le VE presenti in latte e colostro inducono diversi effetti a seconda del loro specifico cargo e delle cellule che le internalizzano. Una criticità significativa nell’isolamento delle VE dal latte è rappresentata dalla presenza delle micelle di caseina, di dimensioni simili a quelle delle VE. L’obbiettivo di questo lavoro è analizzare, nell’ottica del concetto One Health, l’entità dell’uptake sia delle VE derivate sia dal colostro che dal latte maturo, e mettere in luce un loro possibile ruolo nella modulazione della risposta fagocitaria in macrofagi bufalini e in cellule BoMac, oltre a valutare l’impatto sullo stato funzionale di cellule epiteliali intestinali in vitro. Le VE di colostro e di latte a 15 e 60 giorni sono state isolate da latte crudo fornito dall’Istituto Zooprofilattico del Mezzogiorno. Il latte crudo è stato sottoposto a due centrifugazioni consecutive da 3000×g per 10 minuti a temperatura ambiente per allontanare cellule e detriti cellulari nonché la componente grassa del latte. Una volta recuperato il surnatante, è stato aggiunto un volume uguale di 0,25 M EDTA (pH 7,4) per favorire la precipitazione proteica e poi effettuata una ultracentrifugazione del surnatante a 35.000×g per 1 ora a 4 ◦C che ha permesso di allontanare gran parte delle proteine rimanenti. È stato recuperato il surnatante ed effettuata un’ultracentrifugazione finale a 200.000×g per 90 minuti a 4 ◦C. Le VE sono state risospese in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sterile e filtrato con filtro da 0,22um. Le VE isolate sono state marcate con PKH67 e utilizzate per studi di uptake intracellulare a 4h e 24h, in cellule macrofagiche bovine (BoMac), e cellule epiteliali intestinali (Caco-2). Inoltre, i macrofagi bufalini sono stati ottenuti in seguito a differenziamento per adesione su piastra di cellule mononucleate isolate da sangue periferico di bufalo, separate mediante gradiente di densità. Dopo 7 giorni di coltura, questi macrofagi sono stati trattati con VE di colostro e LM e utilizzati per analizzare la modulazione della fagocitosi, valutata tramite somministrazione di E. coli marcati con FITC e con il kit di bioparticelle marcate con pHRodo. Sia in BoMac che Caco-2, i livelli di VEGF nel terreno di coltura sono stati misurati a 24h post-stimolazione mediante metodica ELISA. La produzione di ATP è stata invece valutata esclusivamente nelle cellule intestinali umane mediante il test Seahorse XF Real-time ATP rate assay. Le VE derivate dal colostro hanno mostrato una internalizzazione più elevata sia a 4 che a 24 ore, in entrambe le linee cellulari, BoMac e Caco-2. Le cellule BoMac hanno evidenziato una più elevata internalizzazione rispetto alle cellule intestinali umane. La fagocitosi misurata con E. coli fluorescente, dopo trattamento con VE, non è risultata aumentata; tuttavia, l’osservazione al microscopio confocale ha mostrato una minore adesione batterica, rispetto ai controlli. Ulteriori approfondimenti con bioparticelle marcate con pHrodo, su macrofagi bufalini hanno rivelato che il trattamento con VE di latte maturo (60gg) ha incrementato maggiormente l’attività fagocitaria. Inoltre, nelle cellule pretrattate sia con VE di colostro che con LM è stata rilevata un’aumentata espressione della molecola di superficie CD14, in linea con studi simili condotti sull’uomo (3). Le cellule Caco-2 hanno mostrato una modulazione metabolica indotta dalle VE, che coinvolge sia la produzione basale di ROS che l’attività mitocondriale: infatti, sia a tempi brevi (4h) che a tempi più lunghi (24h), le VE, in particolare quelle di latte precoce (15gg) riducono la produzione di ROS mitocondriali. Questo risultato è stato approfondito con l’analisi della produzione di ATP, sia mitocondriale che glicolitico (glicoATP), evidenziando un aumento del glicoATP. Considerando che lo stress ossidativo è correlato al rilascio di fattori angiogenici, è stata indagata la presenza di specifiche citochine rilevando una significativa diminuzione di VEGF dopo 24h di trattamento con VE. Questi dati mettono in luce il diverso ruolo delle VE derivate dal colostro e dal latte a diversi stadi di maturazione: interessante la modulazione del CD14 e l’aumento dell’attività fagocitaria, più marcata per il latte maturo rispetto al colostro. Nelle cellule intestinali umane, le VE di colostro e latte precoce (15 giorni) sembrano le più efficaci nel modulare i livelli di VEGF, una proteina chiave nella risposta infiammatoria intestinale (4). BIBLIOGRAFIA: 1) Welsh, Joshua A et al. “Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches.” Journal of extracellular vesicles vol. 13,2 (2024): e12404. doi:10.1002/jev2.12404 2) Reif, Shimon et al. “Cow and Human Milk-Derived Exosomes Ameliorate Colitis in DSS Murine Model.” Nutrients vol. 12,9 2589. 26 Aug. 2020, doi:10.3390/nu12092589 3) Vahkal, Brett et al. “Human milk extracellular vesicles modulate inflammation and cell survival in intestinal and immune cells.” Pediatric research, 10.1038/s41390-024-03757-5. 28 Nov. 2024, doi:10.1038/s41390-024-03757-5 4) Zoroddu S, Di Lorenzo B, Paliogiannis P, Mangoni AA, Carru C, Zinellu A. Vascular endothelial growth factor in inflammatory bowel disease: A systematic review and meta-analysis. Eur J Clin Invest. 2025 Mar;55(3):e14361. doi: 10.1111/eci.14361.